ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಗಿಬ್ಬೆರೆಲಿನ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಶೂಟ್ ಅಪಿಕಲ್ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯಲ್ಲಿ ಗಿಬ್ಬೆರೆಲಿನ್‌ಗಳ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತದೆ.

ಕಾಂಡದ ವಾಸ್ತುಶಿಲ್ಪಕ್ಕೆ ಶೂಟ್ ಅಪಿಕಲ್ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ (SAM) ಬೆಳವಣಿಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ. ಸಸ್ಯ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳುಗಿಬ್ಬೆರೆಲ್ಲಿನ್‌ಗಳು(GAs) ಸಸ್ಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಸಂಘಟಿಸುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತವೆ, ಆದರೆ SAM ನಲ್ಲಿ ಅವುಗಳ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಇನ್ನೂ ಸರಿಯಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿಲ್ಲ. ಇಲ್ಲಿ, GA ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಅದರ ಅವನತಿಯನ್ನು ಸಂರಕ್ಷಿಸುತ್ತಾ GA ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಅದರ ಅಗತ್ಯ ನಿಯಂತ್ರಕ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಲು DELLA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ನಾವು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ರೇಷಿಯೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಅವನತಿ-ಆಧಾರಿತ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ GA ಮಟ್ಟಗಳು ಮತ್ತು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂವೇದನೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ನಿಖರವಾಗಿ ದಾಖಲಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ. SAM ನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಈ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲ್‌ಗಳು ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಆರ್ಗನ್ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಾದ ನಡುವೆ ಇರುವ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಇರುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಅವು ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳಾಗಿವೆ. ಲಾಭ ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯ ನಷ್ಟದ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, GA ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ, ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳ ಅಂಗೀಕೃತ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ SAM ನಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಚಿಗುರಿನ ತುದಿಯಲ್ಲಿರುವ ಚಿಗುರಿನ ತುದಿಯ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ (SAM), ಸಸ್ಯದ ಜೀವಿತಾವಧಿಯಲ್ಲಿ ಪಾರ್ಶ್ವ ಅಂಗಗಳು ಮತ್ತು ಕಾಂಡ ನೋಡ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾಡ್ಯುಲರ್ ಮತ್ತು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ಕಾಂಡಕೋಶಗಳ ಗೂಡನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ. ಈ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಘಟಕಗಳು ಅಥವಾ ಸಸ್ಯ ನೋಡ್‌ಗಳು ನೋಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಪಾರ್ಶ್ವ ಅಂಗಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ಎಲೆಯ ಅಕ್ಷಗಳಲ್ಲಿ ಆಕ್ಸಿಲರಿ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತವೆ. ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಸ್ಯ ನೋಡ್‌ಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಸಂಘಟನೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ. ಅರಬಿಡೋಪ್ಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ, ಸಸ್ಯಕ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಕ್ಸಿಲರಿ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳು ರೋಸೆಟ್ ಎಲೆಗಳ ಅಕ್ಷಗಳಲ್ಲಿ ಸುಪ್ತವಾಗಿರುತ್ತವೆ. ಹೂವಿನ ಹಂತಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, SAM ಹೂಗೊಂಚಲು ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ಆಗುತ್ತದೆ, ಉದ್ದವಾದ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಕ್ಸಿಲರಿ ಮೊಗ್ಗುಗಳು, ಕಾಲೈನ್ ಎಲೆಗಳ ಅಕ್ಷಗಳಲ್ಲಿ ಶಾಖೆಗಳು ಮತ್ತು ನಂತರ, ಎಲೆಗಳಿಲ್ಲದ ಹೂವುಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ 2. ಎಲೆಗಳು, ಹೂವುಗಳು ಮತ್ತು ಕೊಂಬೆಗಳ ಆರಂಭವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವಲ್ಲಿ ನಾವು ಗಮನಾರ್ಹ ಪ್ರಗತಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಿದ್ದರೂ, ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳು ಹೇಗೆ ಉದ್ಭವಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದರ ಬಗ್ಗೆ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ತಿಳಿದಿದೆ.
GA ಗಳ ಸ್ಥಳಾವಕಾಶ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳುವುದು ವಿಭಿನ್ನ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ವಿಭಿನ್ನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಈ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ತನ್ನದೇ ಆದ ಪ್ರವರ್ತಕನ ಕ್ರಿಯೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ RGA-GFP ಸಮ್ಮಿಳನದ ಅವನತಿಯ ದೃಶ್ಯೀಕರಣವು ಬೇರುಗಳಲ್ಲಿ ಒಟ್ಟು GA ಮಟ್ಟಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಕುರಿತು ಪ್ರಮುಖ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ15,16. ಆದಾಗ್ಯೂ, RGA ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ17 ಮತ್ತು GA18 ನಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, RGA ಪ್ರವರ್ತಕದ ವಿಭಿನ್ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ RGA-GFP ಯೊಂದಿಗೆ ಗಮನಿಸಿದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಾದರಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಈ ವಿಧಾನವು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕವಾಗಿಲ್ಲ. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಜೈವಿಕ ಸಕ್ರಿಯ ಫ್ಲೋರೊಸೆಸಿನ್ (Fl)-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ GA19,20 ಮೂಲ ಎಂಡೋಕಾರ್ಟೆಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ GA ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು GA ಸಾಗಣೆಯಿಂದ ಅದರ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಟ್ಟಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, GA FRET ಸಂವೇದಕ nlsGPS1 GA ಮಟ್ಟಗಳು ಬೇರುಗಳು, ತಂತುಗಳು ಮತ್ತು ಡಾರ್ಕ್-ಬೆಳೆದ ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶದ ಉದ್ದನೆಯೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ21. ಆದಾಗ್ಯೂ, ನಾವು ನೋಡಿದಂತೆ, GA ಸಾಂದ್ರತೆಯು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಏಕೈಕ ನಿಯತಾಂಕವಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಇದು ಸಂಕೀರ್ಣ ಸಂವೇದನಾ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, DELLA ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾರ್ಗಗಳ ಬಗ್ಗೆ ನಮ್ಮ ತಿಳುವಳಿಕೆಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿ, GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಅವನತಿ-ಆಧಾರಿತ ರೇಷಿಯೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್‌ನ ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಮತ್ತು ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ. ಈ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಲು, ನಾವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾದ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಸರ್ವತ್ರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ರೂಪಾಂತರಿತ GA-ಸೂಕ್ಷ್ಮ RGA ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, ಹಾಗೆಯೇ GA-ಸೂಕ್ಷ್ಮವಲ್ಲದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ರೂಪಾಂತರಿತ RGA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಮ್ಮಿಳನಗಳು ಸರ್ವತ್ರವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಿದಾಗ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ಗೆ ಅಡ್ಡಿಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಈ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಪಾಟಿಯೊಟೆಂಪೊರಲ್ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸೆನ್ಸಿಂಗ್ ಉಪಕರಣದಿಂದ GA ಇನ್‌ಪುಟ್ ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲ್ ಸಂಸ್ಕರಣೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ. GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಸ್ಪಾಟಿಯೊಟೆಂಪೊರಲ್ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ನಕ್ಷೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು SAM ಎಪಿಡರ್ಮಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ GA ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು ನಾವು ಈ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಆರ್ಗನ್ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಾದ ನಡುವೆ ಇರುವ SAM ಕೋಶಗಳ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು GA ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ನ ಅಂಗೀಕೃತ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸುತ್ತದೆ.
ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಬೆಳೆಯುತ್ತಿರುವ ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ GA ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು qmRGA ವರದಿ ಮಾಡಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಕೇಳಿದೆವು. GA ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಯಾಗಿ, DELLA34 ಅವನತಿಯಿಂದ ನೈಟ್ರೇಟ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಈ ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅಂತೆಯೇ, ಹೇರಳವಾದ ನೈಟ್ರೇಟ್ ಪೂರೈಕೆಯಲ್ಲಿ (10 mM NO3−) ಬೆಳೆದ pUBQ10::qmRGA ಸಸಿಗಳಲ್ಲಿನ ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್ ಉದ್ದವು ನೈಟ್ರೇಟ್-ಕೊರತೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳೆದ ಸಸಿಗಳಿಗಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6a). ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ನೈಟ್ರೇಟ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಬೆಳೆದ ಸಸಿಗಳಿಗಿಂತ 10 mM NO3− ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳೆದ ಸಸಿಗಳ ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ GA ಸಂಕೇತಗಳು ಹೆಚ್ಚಿವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6b, c). ಹೀಗಾಗಿ, qmRGA GA ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿನ ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆಯನ್ನು ಸಹ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.
qmRGA ನಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು GA ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು GA ಗ್ರಹಿಕೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿದೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ಸಂವೇದಕ ವಿನ್ಯಾಸದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದಂತೆ, ಸಸ್ಯಕ ಮತ್ತು ಸಂತಾನೋತ್ಪತ್ತಿ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿನ ಮೂರು GID1 ಗ್ರಾಹಕಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಸಸಿಗಳಲ್ಲಿ, GID1-GUS ವರದಿಗಾರ ರೇಖೆಯು GID1a ಮತ್ತು c ಗಳು ಕೋಟಿಲ್ಡಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 3a–c). ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು ಗ್ರಾಹಕಗಳನ್ನು ಎಲೆಗಳು, ಪಾರ್ಶ್ವದ ಬೇರುಗಳ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಾ, ಬೇರುಗಳ ತುದಿಗಳು (GID1b ನ ಮೂಲ ಕ್ಯಾಪ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ) ಮತ್ತು ನಾಳೀಯ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 3a–c) ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ. SAM ಹೂಗೊಂಚಲುಗಳಲ್ಲಿ, ನಾವು GID1b ಮತ್ತು 1c ಗಾಗಿ ಮಾತ್ರ GUS ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7a–c). ಸಿತು ಹೈಬ್ರಿಡೈಸೇಶನ್ ಈ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು SAM ನಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ GID1c ಏಕರೂಪವಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿತು, ಆದರೆ GID1b SAM ನ ಪರಿಧಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ಅನುವಾದ ಸಮ್ಮಿಳನವು SAM ನ ಮಧ್ಯಭಾಗದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಅಥವಾ ಯಾವುದೇ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಹಿಡಿದು ಅಂಗದ ಗಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯವರೆಗೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7m) GID1b ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಶ್ರೇಣೀಕೃತ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಹೀಗಾಗಿ, GID1 ಗ್ರಾಹಕಗಳು ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಒಳಗೆ ಏಕರೂಪವಾಗಿ ವಿತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ. ನಂತರದ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ, GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ನ ಅತಿಯಾದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ qmRGA ಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಬಾಹ್ಯ GA ಅನ್ವಯಕ್ಕೆ ಹೆಚ್ಚಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3d, e). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್‌ನಲ್ಲಿ qd17mRGA ನಿಂದ ಅಳೆಯಲಾದ ಪ್ರತಿದೀಪಕವು GA3 ಚಿಕಿತ್ಸೆಗೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಲ್ಲದಂತಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 3f, g). ಎರಡೂ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗೆ, GID1 ಗ್ರಾಹಕಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ವರ್ಧಿತ ಅಥವಾ ಕಳೆದುಹೋದ ಸಂವೇದಕದ ತ್ವರಿತ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ನಿರ್ಣಯಿಸಲು ಮೊಳಕೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ GA (100 μM GA3) ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಯಿತು. ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು qmRGA ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್ GA ಮತ್ತು GA ಸೆನ್ಸರ್ ಆಗಿ ಸಂಯೋಜಿತ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು GID1 ಗ್ರಾಹಕದ ವಿಭಿನ್ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಸಂವೇದಕದ ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿಯವರೆಗೆ, SAM ನಲ್ಲಿ GA ಸಂಕೇತಗಳ ವಿತರಣೆಯು ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಯೇ ಉಳಿದಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು qmRGA- ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಸಸ್ಯಗಳು ಮತ್ತು pCLV3::mCherry-NLS ಕಾಂಡಕೋಶ ವರದಿಗಾರ35 ಅನ್ನು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಹೆಚ್ಚಿನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ನಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, L1 ಪದರದ ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುತ್ತೇವೆ (ಎಪಿಡರ್ಮಿಸ್; ಚಿತ್ರ 4a, b, ವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪೂರಕ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ), ಏಕೆಂದರೆ L1 SAM ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ36. ಇಲ್ಲಿ, pCLV3::mCherry-NLS ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ-ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಸ್ಥಿರ ಜ್ಯಾಮಿತೀಯ ಉಲ್ಲೇಖ ಬಿಂದುವನ್ನು ಒದಗಿಸಿದೆ37. ಪಾರ್ಶ್ವ ಅಂಗ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ GA ಅತ್ಯಗತ್ಯವೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದ್ದರೂ4, P3 ಹಂತದಿಂದ (ಚಿತ್ರ 4a, b) ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಹೂವಿನ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ (P) ನಲ್ಲಿ GA ಸಂಕೇತಗಳು ಕಡಿಮೆ ಇರುವುದನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ ಯುವ P1 ಮತ್ತು P2 ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂಗಳು ಕೇಂದ್ರ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 4a, b) ಹೋಲುವ ಮಧ್ಯಮ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ. ಅಂಗದ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಮ್ ಗಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಯಿತು, P1/P2 (ಗಡಿ ಬದಿಗಳಲ್ಲಿ) ನಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ P4 ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತಲುಪಿತು, ಹಾಗೆಯೇ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಾದ ನಡುವೆ ಇರುವ ಬಾಹ್ಯ ಪ್ರದೇಶದ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 4a, b ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8a, b). ಈ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಎಪಿಡರ್ಮಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ L2 ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ L3 ಪದರಗಳಲ್ಲಿಯೂ ಸಹ ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8b). qmRGA ಬಳಸಿಕೊಂಡು SAM ನಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ GA ಸಿಗ್ನಲ್‌ಗಳ ಮಾದರಿಯು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8c–f, k). ನಾವು ವಿವರವಾಗಿ ನಿರೂಪಿಸಿದ ಐದು ಸ್ವತಂತ್ರ ರೇಖೆಗಳಿಂದ T3 ಸಸ್ಯಗಳ SAM ನಲ್ಲಿ qd17mRGA ರಚನೆಯನ್ನು ವ್ಯವಸ್ಥಿತವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಗಿದ್ದರೂ, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಪಡೆದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8g–j, l). ಈ ನಿಯಂತ್ರಣ ರೇಖೆಯಲ್ಲಿ, SAM ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಕೇವಲ ಸಣ್ಣ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಪತ್ತೆಯಾಗಿವೆ, ಆದರೆ SAM ಕೇಂದ್ರದಲ್ಲಿ TagBFP ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ VENUS ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟ ಮತ್ತು ಅನಿರೀಕ್ಷಿತ ಇಳಿಕೆ ಕಂಡುಬಂದಿದೆ. qmRGA ಗಮನಿಸಿದ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯು mRGA-VENUS ನ GA-ಅವಲಂಬಿತ ಅವನತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ qmRGA ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ಕೇಂದ್ರದಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅತಿಯಾಗಿ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಬಹುದು ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಸಂಕ್ಷಿಪ್ತವಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಪ್ರಾಥಮಿಕವಾಗಿ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯದ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುವ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸುತ್ತವೆ. ಇಂಟರ್-ಪ್ರೈಮೊರ್ಡಿಯಲ್ ಪ್ರದೇಶದ (IPR) ಈ ವಿತರಣೆಯು ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದುತ್ತಿರುವ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಮ್ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರ ಪ್ರದೇಶದ ನಡುವೆ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಕ್ರಮೇಣ ಸ್ಥಾಪನೆಯಿಂದಾಗಿ, ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಂನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 4c, d).
GID1b ಮತ್ತು GID1c ಗ್ರಾಹಕಗಳ ವಿತರಣೆ (ಮೇಲೆ ನೋಡಿ) GA ಗ್ರಾಹಕಗಳ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು SAM ನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. GA ಯ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯು ಇದರಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರಬಹುದೇ ಎಂದು ನಾವು ಆಶ್ಚರ್ಯಪಟ್ಟಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು, ನಾವು nlsGPS1 GA FRET ಸಂವೇದಕವನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ21. 100 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 10 μM GA4+7 ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾದ nlsGPS1 ನ SAM ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿದ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9a–e), ಇದು sAM ನಲ್ಲಿ GA ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ nlsGPS1 ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಅದು ಬೇರುಗಳಲ್ಲಿ ಮಾಡುತ್ತದೆ21. nlsGPS1 ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ ಆವರ್ತನದ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ವಿತರಣೆಯು SAM ನ ಹೊರ ಪದರಗಳಲ್ಲಿ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ GA ಮಟ್ಟವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಆದರೆ ಅವು SAM ನ ಮಧ್ಯಭಾಗದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಗಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಎತ್ತರದಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4e ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9a,c). qmRGA ನಿಂದ ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದಂತೆಯೇ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ GA ಅನ್ನು SAM ನಲ್ಲಿಯೂ ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಪೂರಕ ವಿಧಾನವಾಗಿ, ನಾವು SAM ಅನ್ನು ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ಅಥವಾ Fl ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ನಿಯಂತ್ರಣವಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಿದ್ದೇವೆ. Fl ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು SAM ನಾದ್ಯಂತ ವಿತರಿಸಲಾಯಿತು, ಕೇಂದ್ರ ಪ್ರದೇಶ ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ ಸೇರಿದಂತೆ, ಕಡಿಮೆ ತೀವ್ರತೆಯಲ್ಲಿ (ಚಿತ್ರ 4j ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 10d). ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಎಲ್ಲಾ ಮೂರು GA-Fl ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ ಗಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಉಳಿದ IPR ನಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹವಾಯಿತು, GA7-Fl IPR ನಲ್ಲಿ ಅತಿದೊಡ್ಡ ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹವಾಯಿತು (ಚಿತ್ರ 4k ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 10a,b). ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ತೀವ್ರತೆಯ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು Fl-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ SAM ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ GA-Fl-ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಪಡೆದ SAM ನಲ್ಲಿ IPR ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ ತೀವ್ರತೆಯ ಅನುಪಾತ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 4l ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 10c). ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಅಂಗ ಗಡಿಗೆ ಹತ್ತಿರವಿರುವ IPR ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ GA ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಇರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಇದು SAM GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಮಾದರಿಯು ಅಂಗಗಳ ಗಡಿಗಳ ಬಳಿ ಇರುವ IPR ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ GA ಗ್ರಾಹಕಗಳ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮತ್ತು GA ಯ ಭೇದಾತ್ಮಕ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಎರಡರಿಂದಲೂ ಉಂಟಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಹೀಗಾಗಿ, ನಮ್ಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಅನಿರೀಕ್ಷಿತ ಸ್ಪಾಟಿಯೊಟೆಂಪೊರಲ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, SAM ನ ಮಧ್ಯಭಾಗ ಮತ್ತು ಆದಿಸ್ವರೂಪದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಬಾಹ್ಯ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ IPR ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ.
SAM ನಲ್ಲಿ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS ನ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಸಮಯ-ವಿಳಂಬ ಚಿತ್ರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ, ಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣೆ ಮತ್ತು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ GA ಪಾತ್ರವನ್ನು ನೀಡಿದರೆ, ಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣಾ ನಿಯತಾಂಕಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಮೊದಲು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ಜೀವಕೋಶ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರದ ನಕ್ಷೆಗಳೊಂದಿಗೆ (ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ವಿಭಜನೆಯಲ್ಲಿ ಮಗಳು ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಬಲಕ್ಕೆ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಯಾಗಿ) ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣೆಯ ದಿಕ್ಕನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೊಪಿಯ ನಕ್ಷೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ (ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಕೋಶಕ್ಕೆ ಮತ್ತು ವಿಭಜನೆಯಲ್ಲಿ ಮಗಳು ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಇಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ; ಚಿತ್ರ 5a,b, ವಿಧಾನಗಳು ಮತ್ತು ಪೂರಕ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ). SAM ಜೀವಕೋಶದ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರದ ನಮ್ಮ ನಕ್ಷೆಗಳು ಹಿಂದಿನ ಅವಲೋಕನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿವೆ 38,39, ಗಡಿಯಲ್ಲಿ ಕನಿಷ್ಠ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರಗಳು ಮತ್ತು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಶೀಲ ಹೂವುಗಳಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದರಗಳೊಂದಿಗೆ (ಚಿತ್ರ 5a). ಪ್ರಧಾನ ಘಟಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (PCA) GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಜೀವಕೋಶ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ತೀವ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5c). GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಇನ್‌ಪುಟ್ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ತೀವ್ರತೆ ಸೇರಿದಂತೆ ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಮುಖ್ಯ ಅಕ್ಷಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ CLV3 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ದಿಕ್ಕಿಗೆ ಆರ್ಥೋಗೋನಲ್ ಆಗಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಉಳಿದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಲ್ಲಿ SAM ಕೇಂದ್ರದಿಂದ ಕೋಶಗಳ ಹೊರಗಿಡುವಿಕೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಸ್ಪಿಯರ್‌ಮ್ಯಾನ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು PCA ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು (ಚಿತ್ರ 5d), IPR ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಂಕೇತಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ (ಚಿತ್ರ 5c, d) ನಡುವೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು, ಇದು IPR ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಂಕೇತವು ಕೋಶ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ದಿಕ್ಕನ್ನು ಮತ್ತು ಬಹುಶಃ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ಸ್ಥಾನವನ್ನು ಪ್ರಭಾವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
a, b SAM ನಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆ (a) ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ (b) ಯ ಶಾಖ ನಕ್ಷೆಗಳು ಏಳು ಸ್ವತಂತ್ರ ಸಸ್ಯಗಳ ಮೇಲೆ ಸರಾಸರಿ (ಕ್ರಮವಾಗಿ ಕೋಶ ವಿಸ್ತರಣೆಯ ಶಕ್ತಿ ಮತ್ತು ದಿಕ್ಕಿಗೆ ಪ್ರಾಕ್ಸಿಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ). c PCA ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಅಸ್ಥಿರಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು: GA ಸಿಗ್ನಲ್, ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ತೀವ್ರತೆ, ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ ಮತ್ತು CLV3 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ. PCA ಘಟಕ 1 ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ತೀವ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಧನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ. PCA ಘಟಕ 2 ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿಯೊಂದಿಗೆ ಧನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು CLV3 ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಋಣಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ. ಶೇಕಡಾವಾರುಗಳು ಪ್ರತಿ ಘಟಕದಿಂದ ವಿವರಿಸಲಾದ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ. d CZ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಅಂಗಾಂಶ ಮಾಪಕದಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲ್, ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ತೀವ್ರತೆ ಮತ್ತು ಮೇಲ್ಮೈ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ ನಡುವಿನ ಸ್ಪಿಯರ್‌ಮ್ಯಾನ್ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ. ಬಲಭಾಗದಲ್ಲಿರುವ ಸಂಖ್ಯೆಯು ಎರಡು ಅಸ್ಥಿರಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಪಿಯರ್‌ಮ್ಯಾನ್ ರೋ ಮೌಲ್ಯವಾಗಿದೆ. ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ/ಋಣಾತ್ಮಕ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವು ಹೆಚ್ಚು ಮಹತ್ವದ್ದಾಗಿರುವ ಸಂದರ್ಭಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಿಂದ Col-0 SAM L1 ಕೋಶಗಳ 3D ದೃಶ್ಯೀಕರಣ. 10 ಗಂಟೆಗಳಲ್ಲಿ SAM ನಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು (ಆದರೆ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ ಅಲ್ಲ) ಅವುಗಳ ಕೋನ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಬಣ್ಣ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಬಣ್ಣದ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಕೆಳಗಿನ ಬಲ ಮೂಲೆಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಇನ್ಸೆಟ್ 0 ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ 3D ಚಿತ್ರವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. f ಬಾಕ್ಸ್ ಪ್ಲಾಟ್‌ಗಳು IPR ಮತ್ತು ನಾನ್-IPR Col-0 SAM ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ದರಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ (n = 10 ಸ್ವತಂತ್ರ ಸಸ್ಯಗಳು). ಮಧ್ಯದ ರೇಖೆಯು ಮಧ್ಯವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಬಾಕ್ಸ್ ಗಡಿಗಳು 25 ನೇ ಮತ್ತು 75 ನೇ ಶೇಕಡಾವಾರುಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳು R ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾದ ಕನಿಷ್ಠ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ. P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ವೆಲ್ಚ್‌ನ ಎರಡು-ಬಾಲದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯೊಂದಿಗೆ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. g, h SAM ನ ಮಧ್ಯಭಾಗದಿಂದ (ಬಿಳಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆ) ರೇಡಿಯಲ್ ದಿಕ್ಕಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ (ಮೆಜೆಂಟಾ) ಕೋನವನ್ನು ಹೇಗೆ ಅಳೆಯುವುದು ಎಂಬುದನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ರೇಖಾಚಿತ್ರ (g) (ಬಿಳಿ ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆ) (ತೀವ್ರ ಕೋನ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಅಂದರೆ 0–90° ಮಾತ್ರ ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ), ಮತ್ತು (h) ಮೆರಿಸ್ಟಮ್‌ನೊಳಗಿನ ಸುತ್ತಳತೆ/ಪಾರ್ಶ್ವ ಮತ್ತು ರೇಡಿಯಲ್ ದಿಕ್ಕುಗಳು. i ಕ್ರಮವಾಗಿ SAM (ಕಡು ನೀಲಿ), IPR (ಮಧ್ಯಮ ನೀಲಿ) ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ (ತಿಳಿ ನೀಲಿ) ಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಆವರ್ತನ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು. P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಎರಡು-ಬಾಲದ ಕೊಲ್ಮೊಗೊರೊವ್-ಸ್ಮಿರ್ನೋವ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. j ಕ್ರಮವಾಗಿ P3 (ತಿಳಿ ಹಸಿರು), P4 (ಮಧ್ಯಮ ಹಸಿರು) ಮತ್ತು P5 (ಕಡು ಹಸಿರು) ಸುತ್ತ IPR ನ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಆವರ್ತನ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು. P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಎರಡು-ಬಾಲದ ಕೊಲ್ಮೊಗೊರೊವ್-ಸ್ಮಿರ್ನೋವ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು.
ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಮುಂದಿನ ಹಂತದಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹೊಸದಾಗಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಮೂಲಕ ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದೆವು (ಚಿತ್ರ 5e). ಈ ವಿಧಾನವು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಆವರ್ತನ ಮತ್ತು ದಿಕ್ಕನ್ನು ಅಳೆಯಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು. ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿ, IPR ಮತ್ತು SAM ನ ಉಳಿದ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ (IPR ಅಲ್ಲದ, ಚಿತ್ರ 5f) ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಆವರ್ತನವು ಹೋಲುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದು IPR ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ ಕೋಶಗಳ ನಡುವಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಮೇಲೆ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಇದು ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ ನಡುವಿನ ಸಕಾರಾತ್ಮಕ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಪ್ರಭಾವಿಸಬಹುದೇ ಎಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು. ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಾವು ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ಕೇಂದ್ರ ಮತ್ತು ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಮಧ್ಯಭಾಗವನ್ನು ಸಂಪರ್ಕಿಸುವ ರೇಡಿಯಲ್ ಅಕ್ಷಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ತೀವ್ರ ಕೋನವಾಗಿ ಅಳೆಯುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 5e-i) ಮತ್ತು ರೇಡಿಯಲ್ ಅಕ್ಷಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ 90° ಗೆ ಹತ್ತಿರವಿರುವ ಕೋನಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು ವಿಭಜನೆಯಾಗುವ ಸ್ಪಷ್ಟ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, 70–80° (23.28%) ಮತ್ತು 80–90° (22.62%) (ಚಿತ್ರ 5e,i) ನಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಧಿಕ ಆವರ್ತನಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಸುತ್ತಳತೆ/ಅಡ್ಡ ದಿಕ್ಕಿನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 5h). ಈ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ನಡವಳಿಕೆಗೆ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಕೊಡುಗೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು IPR ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 5i). IPR ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ವಿಭಜನಾ ಕೋನ ವಿತರಣೆಯು IPR ಅಲ್ಲದ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಸಂಪೂರ್ಣ SAM ನಲ್ಲಿರುವ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುವುದನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, IPR ಕೋಶಗಳು ಪಾರ್ಶ್ವ/ವೃತ್ತಾಕಾರದ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ, ಅಂದರೆ, 70–80° ಮತ್ತು 80–90° (ಕ್ರಮವಾಗಿ 33.86% ಮತ್ತು 30.71%) (ಕ್ರಮವಾಗಿ, ಅನುಗುಣವಾದ ಅನುಪಾತಗಳು) (ಚಿತ್ರ 5i). ಹೀಗಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಸುತ್ತಳತೆಯ ದಿಕ್ಕಿಗೆ ಹತ್ತಿರವಿರುವ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿದವು, ಇದು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಮತ್ತು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೋಲುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 5c, d). ಈ ಸಂಘದ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಸಂರಕ್ಷಣೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು, P3 ರಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ ಸುತ್ತಲಿನ IPR ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಾವು ಅಳೆಯುತ್ತೇವೆ, ಏಕೆಂದರೆ P4 ರಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಈ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಧಿಕ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆ ಪತ್ತೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 4). P3 ಮತ್ತು P4 ಸುತ್ತಲಿನ IPR ನ ವಿಭಜನಾ ಕೋನಗಳು ಯಾವುದೇ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ, ಆದಾಗ್ಯೂ P4 ಸುತ್ತಲಿನ IPR ನಲ್ಲಿ ಪಾರ್ಶ್ವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಹೆಚ್ಚಿದ ಆವರ್ತನವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 5j). ಆದಾಗ್ಯೂ, P5 ಸುತ್ತಲಿನ IPR ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ, ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸವು ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ್ದಾಗಿ ಮಾರ್ಪಟ್ಟಿತು, ಅಡ್ಡ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ತೀವ್ರ ಹೆಚ್ಚಳ ಕಂಡುಬಂದಿತು (ಚಿತ್ರ 5j). ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ SAM ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು ಹಿಂದಿನ ವರದಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ40,41 ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ IPR ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಪಾರ್ಶ್ವ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ.
IPR ನಲ್ಲಿರುವ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಾದಲ್ಲಿ ಅಲ್ಲ, ಬದಲಾಗಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ 2,42,43 ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ. IPR ನಲ್ಲಿರುವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಅಡ್ಡ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವು ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಕೋಶಗಳ ಸಮಾನಾಂತರ ರೇಖಾಂಶದ ಸಾಲುಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಸಂಘಟನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದ ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದಿಕ್ಕನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಹಲವಾರು DELLA ಜೀನ್‌ಗಳ ಕಾರ್ಯದ ನಷ್ಟವು ರಚನಾತ್ಮಕ GA ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ ಊಹೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಡೆಲ್ಲಾ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು44. ನಾವು ಮೊದಲು SAM ನಲ್ಲಿ ಐದು DELLA ಜೀನ್‌ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. GUS ಸಾಲಿನ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಸಮ್ಮಿಳನ45 GAI, RGA, RGL1, ಮತ್ತು RGL2 (ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ) SAM ನಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗಿವೆ ಎಂದು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 11a–d). ಇನ್ ಸಿತು ಹೈಬ್ರಿಡೈಸೇಶನ್ GAI mRNA ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಪ್ರಿಮೊರ್ಡಿಯಾ ಮತ್ತು ಅಭಿವೃದ್ಧಿ ಹೊಂದುತ್ತಿರುವ ಹೂವುಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 11e). RGL1 ಮತ್ತು RGL3 mRNA ಅನ್ನು SAM ಕ್ಯಾನೋಪಿಯಾದ್ಯಂತ ಮತ್ತು ಹಳೆಯ ಹೂವುಗಳಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲಾಯಿತು, ಆದರೆ RGL2 mRNA ಗಡಿ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಹೇರಳವಾಗಿತ್ತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM ನ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಇನ್ ಸಿತು ಹೈಬ್ರಿಡೈಸೇಶನ್ ಗಮನಿಸಿದ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು SAM ನ ಕೇಂದ್ರ ಭಾಗದಲ್ಲಿ RGL3 ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಗ್ರಹವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 11i). pRGA::GFP-RGA ಲೈನ್ ಬಳಸಿ, SAM ನಲ್ಲಿ RGA ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಗ್ರಹವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ P4 ನಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ ಗಡಿಯಲ್ಲಿ ಅದರ ಸಮೃದ್ಧಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 11j). ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, RGL3 ಮತ್ತು RGA ಯ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಮಾದರಿಗಳು qmRGA ನಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ IPR ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿವೆ (ಚಿತ್ರ 4). ಇದಲ್ಲದೆ, ಈ ಡೇಟಾವು ಎಲ್ಲಾ DELLA ಗಳು SAM ನಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣ SAM ಅನ್ನು ವ್ಯಾಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ನಾವು ಮುಂದೆ ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ SAM (Ler, ಕಂಟ್ರೋಲ್) ಮತ್ತು gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 ಡೆಲ್ಲಾ ಕ್ವಿಂಟಪಲ್ (ಗ್ಲೋಬಲ್) ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ನಿಯತಾಂಕಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 6a, b). ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಡೆಲ್ಲಾ ಗ್ಲೋಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ SAM ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ಕೋನ ಆವರ್ತನಗಳ ವಿತರಣೆಯಲ್ಲಿ ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 6c). ಡೆಲ್ಲಾ ಗ್ಲೋಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ಈ ಬದಲಾವಣೆಯು 80–90° ಕೋನಗಳ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳದಿಂದಾಗಿ (34.71% vs. 24.55%) ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ, 70–80° ಕೋನಗಳು (23.78% vs. 20.18%), ಅಂದರೆ, ಅಡ್ಡ-ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 6c). ಅಡ್ಡ-ಅಲ್ಲದ ವಿಭಾಗಗಳ ಆವರ್ತನವು (0–60°) ಡೆಲ್ಲಾ ಗ್ಲೋಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿಯೂ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 6c). ಡೆಲ್ಲಾ ಜಾಗತಿಕ ರೂಪಾಂತರದ SAM ನಲ್ಲಿ ಅಡ್ಡ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಆವರ್ತನವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 6b). ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಡೆಲ್ಲಾ ಜಾಗತಿಕ ರೂಪಾಂತರದಲ್ಲಿ IPR ನಲ್ಲಿ ಅಡ್ಡ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ಆವರ್ತನವು ಹೆಚ್ಚಿತ್ತು (ಚಿತ್ರ 6d). IPR ಪ್ರದೇಶದ ಹೊರಗೆ, ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರವು ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ಕೋನಗಳ ಹೆಚ್ಚು ಏಕರೂಪದ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು, ಆದರೆ ಡೆಲ್ಲಾ ಜಾಗತಿಕ ರೂಪಾಂತರವು IPR ನಂತಹ ಸ್ಪರ್ಶಕ ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು ಆದ್ಯತೆ ನೀಡಿತು (ಚಿತ್ರ 6e). GA ಸಂಗ್ರಹವಾಗುವ GA-ನಿಷ್ಕ್ರಿಯ ರೂಪಾಂತರ ಹಿನ್ನೆಲೆಯಾದ ga2 ಆಕ್ಸಿಡೇಸ್ (ga2ox) ಕ್ವಿಂಟಪಲ್ ರೂಪಾಂತರಗಳ (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ಮತ್ತು ga2ox6-2) SAM ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಾವು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ. GA ಮಟ್ಟಗಳಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಳಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಕ್ವಿಂಟಪಲ್ ga2ox ರೂಪಾಂತರಿತ ಹೂಗೊಂಚಲಿನ SAM Col-0 ಗಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾಗಿತ್ತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 12a, b), ಮತ್ತು Col-0 ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಕ್ವಿಂಟಪಲ್ ga2ox SAM ಕೋಶ ವಿಭಜನೆ ಕೋನಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಕೋನ ಆವರ್ತನವು 50° ರಿಂದ 90° ಗೆ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಅಂದರೆ ಮತ್ತೆ ಸ್ಪರ್ಶಕ ವಿಭಾಗಗಳಿಗೆ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 12a–c). ಹೀಗಾಗಿ, GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು GA ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ರಚನಾತ್ಮಕ ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು IPR ಮತ್ತು SAM ನ ಉಳಿದ ಭಾಗಗಳಲ್ಲಿ ಪಾರ್ಶ್ವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
a, b ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು PI-ಬಣ್ಣದ Ler (a) ಮತ್ತು ಜಾಗತಿಕ ಡೆಲ್ಲಾ ರೂಪಾಂತರ (b) SAM ನ L1 ಪದರದ 3D ದೃಶ್ಯೀಕರಣ. 10-ಗಂಟೆಗಳ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ SAM ನಲ್ಲಿ (ಆದರೆ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂ ಅಲ್ಲ) ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಕೋನ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ ಬಣ್ಣ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಇನ್ಸೆಟ್ SAM ಅನ್ನು 0 ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ. ಬಣ್ಣದ ಪಟ್ಟಿಯನ್ನು ಕೆಳಗಿನ ಬಲ ಮೂಲೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (b) ನಲ್ಲಿರುವ ಬಾಣವು ಜಾಗತಿಕ ಡೆಲ್ಲಾ ರೂಪಾಂತರದಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಸಲಾದ ಕೋಶ ಫೈಲ್‌ಗಳ ಉದಾಹರಣೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು. ce Ler ಮತ್ತು ಜಾಗತಿಕ ಡೆಲ್ಲಾ ನಡುವಿನ ಸಂಪೂರ್ಣ SAM (d), IPR (e), ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ (f) ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳ ಆವರ್ತನ ವಿತರಣೆಯ ಹೋಲಿಕೆ. ಎರಡು-ಬಾಲದ ಕೊಲ್ಮೊಗೊರೊವ್-ಸ್ಮಿರ್ನೋವ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ. f, g Col-0 (i) ಮತ್ತು pCUC2::gai-1-VENUS (j) ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ಸಸ್ಯಗಳ PI-ಬಣ್ಣದ SAM ನ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಚಿತ್ರಗಳ 3D ದೃಶ್ಯೀಕರಣ. (a, b) ಫಲಕಗಳು 10 ಗಂಟೆಗಳ ಒಳಗೆ SAM ನಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೊಸ ಕೋಶ ಗೋಡೆಗಳನ್ನು (ಆದರೆ ಮೂಲರೂಪವಲ್ಲ) ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು. h–j Col-0 ಮತ್ತು pCUC2::gai-1-VENUS ಸಸ್ಯಗಳ ನಡುವೆ ಸಂಪೂರ್ಣ SAM (h), IPR (i) ಮತ್ತು IPR ಅಲ್ಲದ (j) ನಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಂಡಿರುವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನಗಳ ಆವರ್ತನ ವಿತರಣೆಯ ಹೋಲಿಕೆ. ಎರಡು ಬಾಲದ ಕೊಲ್ಮೊಗೊರೊವ್-ಸ್ಮಿರ್ನೋವ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು P ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.
ಮುಂದೆ ನಾವು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ IPR ನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಈ ಉದ್ದೇಶಕ್ಕಾಗಿ, VENUS ಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾದ ಪ್ರಬಲ ಋಣಾತ್ಮಕ gai-1 ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡಲು ನಾವು ಕೋಟಿಲೆಡಾನ್ ಕಪ್ 2 (CUC2) ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (pCUC2::gai-1-VENUS ಸಾಲಿನಲ್ಲಿ). ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ SAM ನಲ್ಲಿ, CUC2 ಪ್ರವರ್ತಕವು P4 ರಿಂದ ಗಡಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ SAM ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ IPR ಗಳ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಮತ್ತು pCUC2::gai-1-VENUS ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಕೆಳಗೆ ನೋಡಿ). pCUC2::gai-1-VENUS ಸಸ್ಯಗಳ SAM ಅಥವಾ IPR ನಾದ್ಯಂತ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಕೋನಗಳ ವಿತರಣೆಯು ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕಿಂತ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರಲಿಲ್ಲ, ಆದರೂ ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿ ಈ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ IPR ಇಲ್ಲದ ಕೋಶಗಳು 80-90° ಹೆಚ್ಚಿನ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ವಿಂಗಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 6f-j).
ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದಿಕ್ಕು SAM ನ ಜ್ಯಾಮಿತಿಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸಲಾಗಿದೆ, ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಅಂಗಾಂಶ ವಕ್ರತೆಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ಕರ್ಷಕ ಒತ್ತಡ46. ಆದ್ದರಿಂದ ನಾವು ಡೆಲ್ಲಾ ಜಾಗತಿಕ ರೂಪಾಂತರಿತ ಮತ್ತು pCUC2::gai-1-VENUS ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ SAM ನ ಆಕಾರವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿದೆಯೇ ಎಂದು ಕೇಳಿದ್ದೇವೆ. ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಿದಂತೆ12, ಡೆಲ್ಲಾ ಜಾಗತಿಕ ರೂಪಾಂತರಿತ SAM ನ ಗಾತ್ರವು ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕಿಂತ ದೊಡ್ಡದಾಗಿತ್ತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 13a, b, d). CLV3 ಮತ್ತು STM RNA ಯ ಇನ್ ಸಿತು ಹೈಬ್ರಿಡೈಸೇಶನ್ ಡೆಲ್ಲಾ ರೂಪಾಂತರಿತಗಳಲ್ಲಿ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು ಕಾಂಡಕೋಶ ಗೂಡಿನ ಪಾರ್ಶ್ವ ವಿಸ್ತರಣೆಯನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ತೋರಿಸಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 13e, f, h, i). ಆದಾಗ್ಯೂ, SAM ವಕ್ರತೆಯು ಎರಡೂ ಜೀನೋಟೈಪ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೋಲುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 13k, m, n, p). ಕಾಡು ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ವಕ್ರತೆಯ ಬದಲಾವಣೆಯಿಲ್ಲದೆ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 13c, d, g, j, l, o, p). ಡೆಲ್ಲಾ ಕ್ವಾಡ್ರುಪಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಆವರ್ತನವು ಸಹ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಿತು, ಆದರೆ ಡೆಲ್ಲಾ ಏಕಶಿಲೆಯ ರೂಪಾಂತರಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 12d-f). ವಕ್ರತೆಯ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮದ ಕೊರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಈ ಡೋಸೇಜ್ ಪರಿಣಾಮವು ಡೆಲ್ಲಾ ಕ್ವಾಡ್ರುಪಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ RGL3 ಚಟುವಟಿಕೆಯು DELLA ಚಟುವಟಿಕೆಯ ನಷ್ಟದಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಮಿತಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು SAM ಜ್ಯಾಮಿತಿಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗಿಂತ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಪಾರ್ಶ್ವ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಸಂಭವಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಮೇಲೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ, CUC2 ಪ್ರವರ್ತಕವು P4 ರಿಂದ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುವ SAM ನಲ್ಲಿ IPR ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 14a, b), ಮತ್ತು ಇದಕ್ಕೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ಕಡಿಮೆ ಗಾತ್ರವನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು ಆದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ವಕ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿತ್ತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿನ ಈ ಬದಲಾವಣೆಯು ವೈಲ್ಡ್ ಪ್ರಕಾರಕ್ಕೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಒತ್ತಡಗಳ ವಿಭಿನ್ನ ವಿತರಣೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸುತ್ತಳತೆಯ ಒತ್ತಡಗಳು SAM ಕೇಂದ್ರದಿಂದ ಕಡಿಮೆ ದೂರದಲ್ಲಿ ಪ್ರಾರಂಭವಾಗುತ್ತವೆ47. ಪರ್ಯಾಯವಾಗಿ, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ರೂಪವಿಜ್ಞಾನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯಿಂದ ಪ್ರೇರಿತವಾದ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗಬಹುದು48. ಎರಡೂ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಇದು ಸುತ್ತಳತೆ/ಅಡ್ಡ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು ವಿಭಜನೆಯಾಗುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಭಾಗಶಃ ಸರಿದೂಗಿಸಬಹುದು, ಇದು ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳನ್ನು ವಿವರಿಸುತ್ತದೆ.
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನಮ್ಮ ದತ್ತಾಂಶವು IPR ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ಪಾರ್ಶ್ವ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಸಕ್ರಿಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸುತ್ತದೆ. ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ವಕ್ರತೆಯು IPR ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಮೇಲೆ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂದು ಅವು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ IPR ನಲ್ಲಿ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ಅಡ್ಡ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವು, GA, SAM ನೊಳಗಿನ ಎಪಿಡರ್ಮಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ರೇಡಿಯಲ್ ಸೆಲ್ ಫೈಲ್ ಅನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಸಂಘಟಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ನಂತರ ಎಪಿಡರ್ಮಲ್ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸುತ್ತದೆ. ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಅಂತಹ ಸೆಲ್ ಫೈಲ್‌ಗಳು ಡೆಲ್ಲಾ ಗ್ಲೋಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ಗಳ SAM ಚಿತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಆಗಾಗ್ಗೆ ಗೋಚರಿಸುತ್ತಿದ್ದವು (ಚಿತ್ರ 6b). ಹೀಗಾಗಿ, SAM ನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್‌ನ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಮಾದರಿಯ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು, ನಾವು ವೈಲ್ಡ್-ಟೈಪ್ (Ler ಮತ್ತು Col-0), ಡೆಲ್ಲಾ ಗ್ಲೋಬಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು pCUC2::gai-1-VENUS ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಜೆನಿಕ್ ಸಸ್ಯಗಳಲ್ಲಿ IPR ನಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಟೈಮ್-ಲ್ಯಾಪ್ಸ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.
IPR ನಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು P1/P2 ನಿಂದ ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು ಮತ್ತು P4 ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟವನ್ನು ತಲುಪಿತು ಎಂದು qmRGA ತೋರಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಮಾದರಿಯು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿ ಉಳಿಯಿತು (ಚಿತ್ರ 4a–f ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8c–f, k). ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ GA ಸಿಗ್ನಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ IPR ನಲ್ಲಿನ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು, ನಾವು ಮೊದಲ ವೀಕ್ಷಣೆಯ ನಂತರ 34 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ ಅವುಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅದೃಷ್ಟದ ಪ್ರಕಾರ P4 ನ ಮೇಲೆ ಮತ್ತು ಬದಿಗಳಿಗೆ Ler IPR ಕೋಶಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಅಂದರೆ, ಎರಡು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಡ್ ಸಮಯಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು, P1/P2 ನಿಂದ P4 ವರೆಗಿನ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಮ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ IPR ಕೋಶಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟಿತು. ನಾವು ಮೂರು ವಿಭಿನ್ನ ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ: P4 ಬಳಿ ಪ್ರೈಮೋರ್ಡಿಯಂಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ಹಳದಿ, IPR ನಲ್ಲಿರುವವುಗಳಿಗೆ ಹಸಿರು ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಭಾಗವಹಿಸಿದ ಕೋಶಗಳಿಗೆ ನೇರಳೆ (ಚಿತ್ರ 7a–c). t0 (0 ಗಂ) ನಲ್ಲಿ, P4 ನ ಮುಂದೆ IPR ಕೋಶಗಳ 1-2 ಪದರಗಳು ಗೋಚರಿಸುತ್ತಿದ್ದವು (ಚಿತ್ರ 7a). ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ಈ ಕೋಶಗಳು ವಿಭಜನೆಯಾದಾಗ, ಅವು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಅಡ್ಡ ವಿಭಾಗ ಸಮತಲದ ಮೂಲಕ ಹಾಗೆ ಮಾಡಿದವು (ಚಿತ್ರ 7a–c). Col-0 SAM ಬಳಸಿ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಯಿತು (P3 ಮೇಲೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸುವುದು, ಇದರ ಗಡಿ Ler ನಲ್ಲಿ P4 ಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ), ಆದಾಗ್ಯೂ ಈ ಜೀನೋಟೈಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೂವಿನ ಗಡಿಯಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಮಡಿಕೆಯು IPR ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವೇಗವಾಗಿ ಮರೆಮಾಡಿದೆ (ಚಿತ್ರ 7g–i). ಹೀಗಾಗಿ, IPR ಕೋಶಗಳ ವಿಭಜನಾ ಮಾದರಿಯು ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳಂತೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ರೇಡಿಯಲ್ ಸಾಲುಗಳಾಗಿ ಪೂರ್ವ-ಸಂಘಟಿಸುತ್ತದೆ. ರೇಡಿಯಲ್ ಸಾಲುಗಳ ಸಂಘಟನೆ ಮತ್ತು ಸತತ ಅಂಗಗಳ ನಡುವೆ IPR ಕೋಶಗಳ ಸ್ಥಳೀಕರಣವು ಈ ಕೋಶಗಳು ಇಂಟರ್ನೋಡಲ್ ಪೂರ್ವಗಾಮಿಗಳಾಗಿವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, ನಾವು ರೇಷಿಯೋಮೆಟ್ರಿಕ್ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಬಯೋಸೆನ್ಸರ್, qmRGA ಅನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಸಂಯೋಜಿತ GA ಮತ್ತು GA ಗ್ರಾಹಕ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಮ್ಯಾಪಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾರ್ಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ GA ಕಾರ್ಯದ ಕುರಿತು ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. ಈ ಉದ್ದೇಶಕ್ಕಾಗಿ, ನಾವು ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ DELLA ಪ್ರೋಟೀನ್, mRGA ಅನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದು DELLA ಸಂವಹನ ಪಾಲುದಾರರನ್ನು ಬಂಧಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಂಡಿದೆ ಆದರೆ GA-ಪ್ರೇರಿತ ಪ್ರೋಟಿಯೋಲಿಸಿಸ್‌ಗೆ ಸೂಕ್ಷ್ಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ. qmRGA GA ಮಟ್ಟಗಳಲ್ಲಿನ ಬಾಹ್ಯ ಮತ್ತು ಅಂತರ್ವರ್ಧಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅದರ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಂವೇದನಾ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ-ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನವನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. qmRGA ಸಹ ಬಹಳ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಾಧನವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ಇದನ್ನು ಅದರ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಗೆ ಬಳಸುವ ಪ್ರವರ್ತಕವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ವಿಭಿನ್ನ ಅಂಗಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು (ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ), ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾರ್ಗದ ಸಂರಕ್ಷಿತ ಸ್ವರೂಪ ಮತ್ತು ಆಂಜಿಯೋಸ್ಪರ್ಮ್‌ಗಳಾದ್ಯಂತ PFYRE ಮೋಟಿಫ್ ಅನ್ನು ನೀಡಿದರೆ, ಇದು ಇತರ ಪ್ರಭೇದಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಬಹುದಾದ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ22. ಇದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಅಕ್ಕಿ SLR1 DELLA ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಲ್ಲಿ (HYY497AAA) ಸಮಾನ ರೂಪಾಂತರವು SLR1 ನ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ನಿರೋಧಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ನಿಗ್ರಹಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು mRGA23 ನಂತೆಯೇ ಅದರ GA-ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯ ಅವನತಿಯನ್ನು ಸ್ವಲ್ಪ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, ಅರಬಿಡೋಪ್ಸಿಸ್‌ನಲ್ಲಿನ ಇತ್ತೀಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು PFYRE ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿನ (S474L) ಒಂದೇ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ರೂಪಾಂತರವು RGA ನ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶ ಪಾಲುದಾರರೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರದೆ ಬದಲಾಯಿಸಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. ಈ ರೂಪಾಂತರವು mRGA ನಲ್ಲಿರುವ 3 ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಪರ್ಯಾಯಗಳಿಗೆ ಬಹಳ ಹತ್ತಿರದಲ್ಲಿದೆಯಾದರೂ, ಈ ಎರಡು ರೂಪಾಂತರಗಳು DELLA ದ ವಿಭಿನ್ನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಅಂಶ ಪಾಲುದಾರರು DELLA26,51 ರ LHR1 ಮತ್ತು SAW ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಬಂಧಿಸಿದರೂ, PFYRE ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಕೆಲವು ಸಂರಕ್ಷಿತ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲಗಳು ಈ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡಬಹುದು.
ಸಸ್ಯ ವಾಸ್ತುಶಿಲ್ಪ ಮತ್ತು ಇಳುವರಿ ಸುಧಾರಣೆಯಲ್ಲಿ ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯು ಪ್ರಮುಖ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ. qmRGA IPR ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಮೂಲಜನಕ ಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು. ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಚಿತ್ರಣ ಮತ್ತು ತಳಿಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ, GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾದರಿಗಳು SAM ಎಪಿಡರ್ಮಿಸ್‌ನಲ್ಲಿ ವೃತ್ತಾಕಾರದ/ಅಡ್ಡ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲಗಳನ್ನು ಅತಿಕ್ರಮಿಸುತ್ತವೆ, ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಂಘಟನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಹಲವಾರು ನಿಯಂತ್ರಕಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ52,53. GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಈ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ನಿಯತಾಂಕವನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ನಮ್ಮ ಕೆಲಸವು ಸ್ಪಷ್ಟ ಉದಾಹರಣೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ. DELLA ಪೂರ್ವ-ಮಡಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಬಹುದು41, ಆದ್ದರಿಂದ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಪ್ರಭಾವಿಸುವ ಮೂಲಕ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬಹುದು40,41,54,55. SAM ನಲ್ಲಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವು ಕೋಶ ಉದ್ದ ಅಥವಾ ವಿಭಜನೆಯಲ್ಲ, ಆದರೆ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಅನಿಸೊಟ್ರೋಪಿ ಮಾತ್ರ ಎಂದು ನಾವು ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿ ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು IPR ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದಿಕ್ಕಿನ ಮೇಲೆ GA ಯ ನೇರ ಪರಿಣಾಮದೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಪರಿಣಾಮವು ಪರೋಕ್ಷವಾಗಿರಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಹೊರಗಿಡಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ GA-ಪ್ರೇರಿತ ಕೋಶ ಗೋಡೆ ಮೃದುಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುವುದು56. ಕೋಶ ಗೋಡೆಯ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಯಾಂತ್ರಿಕ ಒತ್ತಡವನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡುತ್ತವೆ57,58, ಇದು ಕಾರ್ಟಿಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್‌ಗಳ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವ ಮೂಲಕ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲದ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಮೇಲೂ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರಬಹುದು39,46,59. GA-ಪ್ರೇರಿತ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಒತ್ತಡ ಮತ್ತು GA ನಿಂದ ಮೈಕ್ರೋಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ನೇರ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಸಂಯೋಜಿತ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು IPR ನಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರಬಹುದು ಮತ್ತು ಈ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಅದೇ ರೀತಿ, ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ರಚನೆಯ ನಿಯಂತ್ರಣದಲ್ಲಿ DELLA-ಸಂವಹನ ಮಾಡುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಾದ TCP14 ಮತ್ತು 15 ರ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸಿವೆ60,61 ಮತ್ತು ಈ ಅಂಶಗಳು ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮತ್ತು GA ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಪ್ರಭಾವಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ2,62. ಡೆಲ್ಲಾಗಳು ಬ್ರಾಸಿನೋಸ್ಟೆರಾಯ್ಡ್, ಎಥಿಲೀನ್, ಜಾಸ್ಮೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಅಬ್ಸಿಸಿಕ್ ಆಮ್ಲ (ABA) ಸಿಗ್ನಲಿಂಗ್ ಮಾರ್ಗಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಈ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳು ಮೈಕ್ರೋಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್ ದೃಷ್ಟಿಕೋನವನ್ನು ಪ್ರಭಾವಿಸುತ್ತವೆ65, ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ದೃಷ್ಟಿಕೋನದ ಮೇಲೆ GA ಯ ಪರಿಣಾಮಗಳು ಇತರ ಹಾರ್ಮೋನುಗಳಿಂದಲೂ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸಬಹುದು.
ಆರಂಭಿಕ ಸೈಟೋಲಾಜಿಕಲ್ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಅರಬಿಡೋಪ್ಸಿಸ್ SAM ನ ಒಳ ಮತ್ತು ಹೊರ ಭಾಗಗಳೆರಡೂ ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿವೆ2,42. ಒಳಗಿನ ಅಂಗಾಂಶಗಳಲ್ಲಿ GA ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯನ್ನು ಸಕ್ರಿಯವಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಅಂಶವು12 SAM ನಲ್ಲಿ ಮೆರಿಸ್ಟಮ್ ಮತ್ತು ಇಂಟರ್ನೋಡ್ ಗಾತ್ರವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವಲ್ಲಿ GA ಯ ದ್ವಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಬೆಂಬಲಿಸುತ್ತದೆ. ದಿಕ್ಕಿನ ಕೋಶ ವಿಭಜನೆಯ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಒಳಗಿನ SAM ಅಂಗಾಂಶದಲ್ಲಿಯೂ ಬಿಗಿಯಾಗಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ ನಿಯಂತ್ರಣವು ಕಾಂಡದ ಬೆಳವಣಿಗೆಗೆ ಅತ್ಯಗತ್ಯ52. ಒಳಗಿನ SAM ಸಂಘಟನೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಶ ವಿಭಜನಾ ಸಮತಲವನ್ನು ಓರಿಯಂಟ್ ಮಾಡುವಲ್ಲಿ GA ಸಹ ಪಾತ್ರ ವಹಿಸುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ಪರಿಶೀಲಿಸುವುದು ಆಸಕ್ತಿದಾಯಕವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ SAM ಒಳಗೆ ಇಂಟರ್ನೋಡ್‌ಗಳ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ ಮತ್ತು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಸಿಂಕ್ರೊನೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.
ಸಸ್ಯಗಳನ್ನು ಮಣ್ಣಿನಲ್ಲಿ ಅಥವಾ 1x ಮುರಾಶಿಗೆ-ಸ್ಕೂಗ್ (MS) ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (ಡುಚೆಫಾ) 1% ಸುಕ್ರೋಸ್ ಮತ್ತು 1% ಅಗರ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (16 ಗಂಟೆಗಳ ಬೆಳಕು, 22 °C) ಪೂರಕವಾಗಿ ವಿಟ್ರೋದಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು, ಹೈಪೋಕೋಟೈಲ್ ಮತ್ತು ಬೇರು ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಇದರಲ್ಲಿ ಮೊಳಕೆಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರ ಬೆಳಕು ಮತ್ತು 22 °C ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಲಂಬ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು. ನೈಟ್ರೇಟ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, ದೀರ್ಘ-ದಿನದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಕಷ್ಟು ನೈಟ್ರೇಟ್ (0 ಅಥವಾ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-ಸಕ್ಸಿನೇಟ್, 1% ಸುಕ್ರೋಸ್ ಮತ್ತು 1% A-ಅಗರ್ (ಸಿಗ್ಮಾ) ನೊಂದಿಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿ ಮಾರ್ಪಡಿಸಿದ MS ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ (bioWORLD ಸಸ್ಯ ಮಾಧ್ಯಮ) ಸಸ್ಯಗಳನ್ನು ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು.
pDONR221 ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ GID1a cDNA ಅನ್ನು pDONR P4-P1R-pUBQ10 ಮತ್ತು pDONR P2R-P3-mCherry ನೊಂದಿಗೆ pB7m34GW ಗೆ ಮರುಸಂಯೋಜಿಸಿ pUBQ10::GID1a-mCherry ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು. pDONR221 ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾದ IDD2 DNA ಅನ್ನು pB7RWG266 ಗೆ ಮರುಸಂಯೋಜಿಸಿ p35S:IDD2-RFP ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಯಿತು. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, GID1b ಕೋಡಿಂಗ್ ಪ್ರದೇಶದ ಮೇಲ್ಮುಖವಾಗಿ 3.9 kb ತುಣುಕನ್ನು ಮತ್ತು GID1b cDNA (1.3 kb) ಮತ್ತು ಟರ್ಮಿನೇಟರ್ (3.4 kb) ಹೊಂದಿರುವ 4.7 kb ತುಣುಕನ್ನು ಮೊದಲು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 3 ರಲ್ಲಿನ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಕ್ರಮವಾಗಿ pDONR P4-P1R (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಮತ್ತು pDONR P2R-P3 (ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಗೇಟ್‌ವೇ ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಬಳಸಿ pGreen 012567 ಗುರಿ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ pDONR221 2xmTQ268 ನೊಂದಿಗೆ ಮರುಸಂಯೋಜಿಸಲಾಯಿತು. pCUC2::LSSmOrange ಅನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು, CUC2 ಪ್ರವರ್ತಕ ಅನುಕ್ರಮ (ATG ಯ ಅಪ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ನಲ್ಲಿ 3229 bp) ನಂತರ N7 ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಲೋಕಲೈಸೇಶನ್ ಸಿಗ್ನಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ದೊಡ್ಡ ಸ್ಟೋಕ್ಸ್-ಶಿಫ್ಟ್ ಮಾಡಿದ mOrange (LSSmOrange)69 ನ ಕೋಡಿಂಗ್ ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು NOS ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನಲ್ ಟರ್ಮಿನೇಟರ್ ಅನ್ನು ಗೇಟ್‌ವೇ 3-ಫ್ರಾಗ್ಮೆಂಟ್ ರಿಕಾಂಬಿನೇಷನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜೆನ್) ಬಳಸಿ pGreen ಕನಮೈಸಿನ್ ಟಾರ್ಗೆಟಿಂಗ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ಗೆ ಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು. ಸಸ್ಯ ಬೈನರಿ ವೆಕ್ಟರ್ ಅನ್ನು ಆಗ್ರೋಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಂ ಟ್ಯೂಮೆಫೇಸಿಯನ್ಸ್ ಸ್ಟ್ರೈನ್ GV3101 ಗೆ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಆಗ್ರೋಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಂ ಇನ್‌ಫಿಲ್ಟ್ರೇಶನ್ ವಿಧಾನದಿಂದ ನಿಕೋಟಿಯಾನಾ ಬೆಂಥಾಮಿಯಾನಾ ಎಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಫ್ಲೋರಲ್ ಡಿಪ್ ವಿಧಾನದಿಂದ ಅರಬಿಡೋಪ್ಸಿಸ್ ಥಾಲಿಯಾನಾ Col-0 ಗೆ ಕ್ರಮವಾಗಿ ಪರಿಚಯಿಸಲಾಯಿತು. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ಮತ್ತು pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಆಯಾ ಶಿಲುಬೆಗಳ F3 ಮತ್ತು F1 ಸಂತತಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಯಿತು.
ಸರಿಸುಮಾರು 1 ಸೆಂ.ಮೀ ಉದ್ದದ ಚಿಗುರು ತುದಿಗಳಲ್ಲಿ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಇನ್ ಸಿತು ಹೈಬ್ರಿಡೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು72, ಇವುಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ತಕ್ಷಣವೇ FAA ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ (3.7% ಫಾರ್ಮಾಲ್ಡಿಹೈಡ್, 5% ಅಸಿಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ, 50% ಎಥೆನಾಲ್) 4 °C ಗೆ ಪೂರ್ವ-ತಂಪಾಗಿಸಲಾಯಿತು. 2 × 15 ನಿಮಿಷಗಳ ನಿರ್ವಾತ ಚಿಕಿತ್ಸೆಗಳ ನಂತರ, ಸ್ಥಿರೀಕರಣವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು. ರೋಸಿಯರ್ ಮತ್ತು ಇತರರು ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 3 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅವುಗಳ 3′-UTR ಗಳಿಗೆ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ಮತ್ತು RGL3 cDNA ಗಳು ಮತ್ತು ಆಂಟಿಸೆನ್ಸ್ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಯಿತು. ಡಿಗೋಕ್ಸಿಜೆನಿನ್-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಡಿಗೋಕ್ಸಿಜೆನಿನ್ ಪ್ರತಿಕಾಯಗಳನ್ನು (3000-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ; ರೋಚೆ, ಕ್ಯಾಟಲಾಗ್ ಸಂಖ್ಯೆ: 11 093 274 910) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇಮ್ಯುನೊಡೆಟೆಕ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ವಿಭಾಗಗಳನ್ನು 5-ಬ್ರೋಮೋ-4-ಕ್ಲೋರೋ-3-ಇಂಡೋಲಿಲ್ ಫಾಸ್ಫೇಟ್ (BCIP, 250-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ)/ನೈಟ್ರೋಬ್ಲೂ ಟೆಟ್ರಾಜೋಲಿಯಮ್ (NBT, 200-ಪಟ್ಟು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ) ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ.